คลอโรฟิลล์เป็นเม็ดสีเขียวที่พบในพืชชั้นสูงและสิ่งมีชีวิตสังเคราะห์แสงอื่นๆ คลอโรฟิลล์เอและคลอโรฟิลล์บีสามารถละลายได้ในเอทานอล อีเธอร์ และอะซิโตน และตัวทำละลายอื่นๆ ซึ่งไม่ละลายในน้ำและปิโตรเลียมอีเทอร์ ดังนั้น สามารถใช้ตัวทำละลายขั้วเช่นอะซิโตน เมทานอล เอทานอล เอทิลอะซิเตต และอื่นๆ เพื่อสกัดคลอโรฟิลล์
กระบวนการสกัดคลอโรฟิลล์:
การสกัดคลอโรฟิลล์จัดทำขึ้นในห้องกึ่งมืดที่อุณหภูมิ 25 องศาเซลเซียส ขั้นตอนการสกัดมีดังนี้
(1) นำใบสีเขียวสด 1,000 กรัมมาบดใน Wechsler
(2) ใส่ใบสีเขียว 1,000 กรัมที่บดแล้วลงในอะซิโตนด้วยแคลเซียมคาร์บอเนตเล็กน้อย (อุณหภูมิ 20 องศา ) เพื่อสกัดจนเศษใบไม่มีสีหลังจากกรองและทำความสะอาด
(3) ใส่สารสกัดอะซิโตนที่กรองแล้วลงในกรวยที่มีปิโตรเลียมอีเทอร์ 1 ลิตรและอะซิโตน 100 มล. จากนั้นหมุนเบา ๆ ขณะที่เติมน้ำกลั่นจนเป็นชั้น อะซิโตนและสิ่งเจือปนที่ละลายน้ำได้ส่วนใหญ่ในชั้นน้ำจะถูกทิ้ง เหลือเพียงสารละลายปิโตรเลียมอีเทอร์
(4) หลังจากที่สารละลายปิโตรเลียมอีเทอร์ถูกทำให้บริสุทธิ์อีกครั้งด้วยน้ำกลั่น จะถูกทำความสะอาดมากกว่า 5 ครั้งด้วยสารละลายเมทานอล 200 มิลลิลิตร 80 เปอร์เซ็นต์ที่มีปิโตรเลียมอีเทอร์และกรดออกซาลิก 0.01 กรัม และสุดท้ายได้สารแขวนลอยสีเขียวอมเหลือง .
(5) ทำให้สารแขวนลอยแห้งด้วยโซเดียมซัลเฟตปราศจากน้ำ และแทรกซึมเข้าไปในคอลัมน์ที่ทำจากผงซูโครสหนา 3 ซม. จากนั้นทำความสะอาดเม็ดสีที่ตกตะกอนเพื่อขจัดแคโรทีนอยด์และทำให้มีคลอโรฟิลล์ตามธรรมชาติเท่านั้น
(6) คอลัมน์ซูโครสที่มีคลอโรฟิลล์ตามธรรมชาติแบ่งออกเป็นสองชั้น ชั้นสีเขียวมีชั้นคลอโรฟิลล์ B 4-10มม. ส่วนชั้นสีน้ำเงินอีกชั้นหนึ่งคือชั้นคลอโรฟิลล์ เอ 2-6มม.
(7) ส่วนที่อยู่ตรงกลางของชั้นสีน้ำเงิน (ประมาณครึ่งหนึ่งของชั้นสีน้ำเงิน) ถูกใส่เข้าไปในอีเทอร์ สารแขวนลอยจะถูกกรองและสกัด ทำความสะอาดด้วยน้ำกลั่น ตากให้แห้งด้วยโซเดียมซัลเฟต และกรองด้วยภาชนะเพื่อให้ได้คลอโรฟิลล์ ก.
(8) ถอดส่วนตรงกลางของชั้นสีเขียวใน (6) แล้วใส่ลงในอีเธอร์อย่างรวดเร็วเพื่อกรองและล้างเพื่อทำสารละลายคลอโรฟิลล์ บี อีเธอร์
วิธีการแยกระหว่างการสกัด?
โครมาโตกราฟีเป็นวิธีการที่สำคัญสำหรับการแยก การทำให้บริสุทธิ์ และการระบุสารประกอบอินทรีย์ โดยเฉพาะอย่างยิ่งในการวิเคราะห์ระดับจุลภาคที่ใช้กันอย่างแพร่หลาย เม็ดสีในผักและผลไม้ส่วนใหญ่ประกอบด้วยแคโรทีนที่ละลายในไขมัน ลูทีน คลอโรฟิลล์ และแอนโธไซยานินที่ละลายน้ำได้ ในการทดลองการสกัด เราสามารถใช้หลักการของการกรองแอนโธไซยานินที่ละลายน้ำได้ผสมกันได้ ซึ่งในทางกลับกันก็สามารถใช้โครมาโตกราฟีแบบชั้นบาง โครมาโตกราฟีแบบคอลัมน์ โครมาโตกราฟีของเหลวประสิทธิภาพสูง (HPLC) เพื่อแยกเบต้าแคโรทีน ลูทีน และคลอโรฟิลล์ที่อ่อนแอลงเนื่องจากขั้วของเม็ดสีทั้งสามชนิด สามารถเลือกตัวทำละลายอินทรีย์เดี่ยวหรืออัตราส่วนที่แตกต่างกันของตัวทำละลายผสมเป็นตัวขยายและตัวชะได้อย่างเหมาะสม กำหนดเงื่อนไขการแยกที่เหมาะสมที่สุด
